標準品溶液配置有誤

確認是否進行正確稀釋。

標準品復溶不當

開蓋前進行離心；檢查復溶后是否存在不溶物。

標準品已降解

按推薦方式保存和處理標準品。

曲線的標度不適合

嘗試使用不同標度繪制曲線，例如雙對數、5 參數擬合。

移液器加樣誤差

正確使用經過校準的移液器

孵育時間過短

樣品在 4 ℃ 孵育過夜，或遵循試劑的實驗方案。

靶標含量低于檢測范圍

減小樣品的稀釋倍數或濃縮樣品。

樣品類型不適用

對于沒有驗證過的樣品類型，檢測信號可能減弱或沒有使用驗證過的樣品類型作為陽性對照同時進行檢測。

抗原表位被孔板吸附，無法識別

使用直接或間接 ELISA 方法增強檢測肽的能力，將肽偶聯到大的載體蛋白上，然后包被到微量滴定板。

檢測緩沖液的相容性

確保檢測緩沖液與靶標兼容（例如，保留酶活性、保留蛋白質相互作用）。

檢測試劑不足

遵循試劑的實驗方案，增加檢測試劑的濃度或用量。

樣品制備不正確

確保進行正確的樣品制備/稀釋。樣品可能與微量滴定板測定形式不兼容。

抗體不足

嘗試不同的抗體濃度/稀釋。

孵育溫度過低

確保在正確溫度下進行孵育。所有試劑（包括孔板）在進行實驗前應處于室溫，或試劑的實驗方案所建議的溫度。

波長不正確

確認波長，再次讀板。

孔板被強力洗滌

檢查并確保自動洗滌系統的壓力正確。如果手動洗滌，則輕輕吸取沖洗緩沖液。

孔變干

測定開始后，不要讓孔變干。將所有的孵育步驟使用封口膜或膠帶密封孔板。

酶反應的顯色速度慢

使用前配制底物溶液。確保母液未過期、未污染。延長孵育時間。

孔中有氣泡

讀板前，確保不存在氣泡。

孔洗滌不均/未充分洗滌

檢查洗板機的所有管口是否暢通。使用推薦方法進行洗滌。

試劑混勻不充分

確保所有試劑充分混勻。

移液量不一致

正確使用經過校準的移液器

邊緣效應

確保孔板和所有試劑處于室溫。

樣品制備或保存條件不一致

確保樣品制備保持一致，使用合適樣品保存條件（例如盡可能減少反復凍融）。

孔洗滌不充分

按照實驗方案建議進行洗滌。

洗滌緩沖液污染

制備新鮮的洗滌緩沖液。

檢測試劑過多

確保試劑被正確稀釋或者減少檢測試劑的推薦濃度。

封閉緩沖液無效（例如檢測試劑結合封閉劑；孔未封閉）

嘗試不同的封閉劑和/或將封閉劑添加到洗滌緩沖液。

孵育/洗滌緩沖液的鹽濃度

增加鹽濃度可能會降低非特異性和/或減弱脫靶相互作用。

讀板前加入終止液后時間太長

添加終止液后立即讀板。

抗體出現非特異性結合

使用適當的封閉緩沖液，例如 BSA 或 5-10% 正常血清，如果是直標一抗，使用與一抗種屬相同的血清，如果是非直標一抗，則使用與二抗種屬相同的血清。確保孔已經過預處理，以防止非特異性附著。

高抗體濃度

嘗試不同的稀釋度，以獲得好的結果。

底物孵育在光下進行

底物孵育應避光進行，或根據試劑的實驗方案建議進行。

底物加入后孔中有沉淀生成

增大樣品的稀釋倍數或降低底物濃度。

孔板臟

清潔孔板底部。

ELISA 試劑盒保存不當

按推薦方式保存所有試劑。請注意，各試劑的保存條件可能有所不同。

靶標不足

濃縮樣品或降低樣品稀釋度。

檢測試劑失活

確保報告酶/熒光素具有預期的活性。

酶標儀設置不正確

在檢測中，確保酶標儀設置為正確的吸收波長或激發/發射波長。

測定方法不夠靈敏

更換更靈敏的檢測系統（例如從比色檢測轉變為化學發光/熒光檢測）。更換更靈敏的測定方法（例如從直接 ELISA 方法轉變為夾心 ELISA 方法）。延長孵育時間或升高溫度。

微量滴定板吸附靶標的效果不佳

將靶標共價結合到微量滴定板。

底物不足

加入更多底物。

樣品類型不兼容（例如血清與細胞提取物）

對于沒有驗證過的樣品種屬，檢測信號可能減弱或沒有。使用驗證過的樣品類型作為陽性對照同時進行檢測。

緩沖液或樣品成分干擾

確認試劑中是否存在干擾性化合物。例如，抗體中的die氮化鈉會抑制 HRP 酶，在血漿中用作抗凝劑的 EDTA 會抑制酶反應。

混合或混用不同試劑盒的試劑

避免混合來自不同試劑盒的試劑。